神经细胞的静息膜电位（Resting Membrane Potential, RMP）影响着神经细胞的可兴奋性，对于维持神经细胞正常的生理功能至关重要。钠漏通道NALCN（Sodium Leak Channel, Nonselective）介导了神经细胞的钠漏电流，能使静息膜电位更加去极化，从而提高神经细胞的可兴奋性^1-4。NALCN在哺乳动物中高度保守，与电压门控钙离子通道（CaV）和电压门控钠离子通道（NaV）同源性较高。NALCN参与了诸多与神经系统相关的重要的生物学过程，包括呼吸节律的调节¹、痛觉感知⁵、生物钟的调节⁶和快速动眼睡眠⁷等。在人群中，NALCN的单点突变就会引起多种严重的神经发育遗传疾病，包括精神运动发育迟缓和具有特征面相的小儿肌张力低下症（IHPRF）^8,9，以及四肢和面部先天性挛缩、肌张力低下和发育迟缓症（CLIFAHDD）¹⁰等。尽管NALCN通道有着如此重要的功能，但其工作机制仍不清楚。有报道显示在HEK293细胞和爪蟾卵母细胞等异源体系中，只有共同表达NALCN，FAM155，UNC79和UNC80四个亚基，才能测量到明显并且典型的钠漏电流⁴。其中，NALCN是孔道形成亚基；FAM155是跨膜胞外调控亚基¹¹，协助NALCN上膜；而UNC79和UNC80是分子量巨大（300 kDa和370 kDa），且不与任何已知蛋白具有序列同源性的胞质调控亚基³。

2022年5月12日，北京大学未来技术学院分子医学研究所、北大-清华生命科学联合中心、国家生物医学成像中心陈雷研究组在Nature Communications 杂志上报道NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80复合物的冷冻电镜结构及UNC79-UNC80调节NALCN-FAM155A的机制。

陈雷研究组在2020年曾报道过NALCN-FAM155A亚复合体的高分辨率结构¹²，阐明了NALCN的钠离子选择性、胞外钙离子阻塞和电压调节特性的结构基础，发现了在NALCN通道中独有的位于II-III linker上的CIH螺旋结合在CTD上。但是UNC79和UNC80的结构以及它们是如何激活NALCN的并不清楚。本项研究主要使用结构生物学及电生理的手段，来探究UNC79和UNC80是如何激活NALCN的。先前的研究表明，UNC79和UNC80容易与NALCN-FAM155A亚复合体发生解离，因此，作者在NALCN的C末端融合了GFP，UNC80的N末端融合了与GFP高亲和力结合的纳米抗体以稳定UNC79/80与NALCN间的相互作用。经过同源蛋白筛选等步骤，作者们确定以大鼠NALCN和小鼠FAM155A, UNC79和UNC80亚基组成的复合体为研究对象，并在克服了样品制备、数据处理等困难后，通过单颗粒冷冻电镜技术获得了整体分辨率为3.2 Å的四元复合物的电子密度，并搭建了准确的原子模型。结构显示UNC79和UNC80均由富含螺旋的结构组成，这些螺旋进一步的组装成HEAT重复或ARM重复等超螺旋结构。UNC79的N端与UNC80的C端、UNC79与UNC80的中间铰链区以及UNC79的C端与UNC80的N端均存在着紧密的相互作用，形成钳子状的复合体，整体形状类似于无穷号“∞”（图1）。除了HEAT重复和ARM重复外，UNC80含有一个类泛素结构域，并且UNC79和UNC80的还各含有一个锌指结构域。NALCN-FAM155A亚复合体位于UNC79和UNC80的中间铰链区的上方，并且NALCN的跨膜区以及胞质C端结构域（CTD）并不直接与UNC79和UNC80发生相互作用。NALCN主要是通过胞内loop区与UNC79-UNC80发生相互作用的：NALCN胞质侧的I-II linker中的一段β-发卡结构（UNIM-A）与UNC79发生相互作用，II-III linker中的一段loop-螺旋结构（UNIM-B）以及一段L型螺旋结构（UNIM-C）与UNC80发生相互作用（图1）。作者将NALCN与UNC79/80发生相互作用的基序命名为UNC Interacting Motif (UNIM)。

图1：NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80复合体的结构

随后作者基于该结构研究了UNC79和UNC80是如何调控NALCN活性的，发现UNC79, UNC80和FAM155A三个附属亚基对于NALCN能够正确的转运到细胞膜上是必不可少的。当突变UNIM-A或UNIM-B以破坏UNIM-A或UNIM-B与UNC79/80的相互作用后，能够正确转运到细胞膜上的NALCN变得很少，钠漏电流也变得很小，表明UNIM-A和UNIM-B与UNC79/80之间的互作对于NALCN能够正确转运到细胞膜上是必不可少的。这有可能是因为这些互作使UNC79/80遮挡了NALCN胞质侧loop上的内质网滞留信号，从而促进NALCN上膜（图2）。

图2：UNC79-UNC80激活NALCN的机制的示意图

与UNIM-A和UNIM-B不同的是，当突变UNIM-C以破坏UNIM-C与UNC79/80的相互作用后，NALCN的上膜和钠漏电流的大小均不受影响，但NALCN更难以被电压激活，电导-电压曲线（G-V curve）发生明显右移。作者们发现UNIM-C与UNC80的互作会牵引II-III linker中原本结合在NALCN的CTD上的一段螺旋（CTD Interacting Helix, CIH）与CTD发生解离，从而解除CIH的自抑制作用，激活NALCN（图2）。

该项研究在2021年12月21日即公布在预印本BioRxiv上（https://doi.org/10.1101/2021.12.20.473568）。在2021年12月美国基因泰克公司的Jian Payandeh研究组和2022年4月西湖大学的闫浈研究组分别在Nature¹³和Cell Discovery¹⁴杂志上也报道了人源的NALCN-FAM155A-UNC79-UNC80复合体的冷冻电镜结构。与这些研究相比，本研究观察到的结构整体相似，并且通过功能实验阐明了UNC79-UNC80是如何通过促进NALCN上膜以及解除CIH自抑制作用来激活NALCN的，为深入理解NALCN复合体的工作机制奠定了基础。

本项研究第一作者为陈雷课题组博士后康云路，陈雷为第二作者兼通讯作者。本工作获得科技部重点研发计划、国家自然科学基金委、北大-清华生命科学联合中心等经费支持。康云路获得了北京大学博雅博士后奖学金的支持。该工作的冷冻电镜样品制备、筛选和采集在北京大学冷冻电镜平台上完成，得到了李雪梅、郭振玺、秦昌东、裴霞和王国鹏等人的帮助。该项目的数据处理获得了北京大学CLS计算平台及未名超算平台的硬件和技术支持。宾夕法尼亚大学Dejian Ren教授提供了大鼠和人源NALCN，小鼠UNC79和UNC80的cDNA。

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3. Lu, B. et al. Extracellular calcium controls background current and neuronal excitability via an UNC79-UNC80-NALCN cation channel complex. Neuron 68, 488-499, doi:10.1016/j.neuron.2010.09.014 (2010).

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